12.11.2013 13:21

Очередное применение стволовых клеток при ортопедических заболеваниях

Культура клеток под микроскопомНа этой неделе в ветеринарной клинике «Новый Век» проведена очередная процедура лечения ортопедических заболеваний с применением мезенхимальной культуры стволовых клеток. В этот раз, лошади с повреждением сухожилия поверхностного сгибателя пальца была введена  культура стволовых клеток, а также эта процедура была сделана и собаке с повреждением крестовидных связок коленного сустава.

Процедура выделения и выращивания мезенхимальных стволовых клеток проведена в Центре ветеринарной клеточной медицины (г. Москва), за что выражаем большую благодарность.

 

Ветеринарная клиника «Новый Век» - первая ветеринарная клиника в Российской Федерации, которая начала применять обогащённую культуру мезенхиальных стволовых клеток при ортопедических заболеваниях лошадей и собак (с 2008 года).

На сегодняшний день  подобная процедура была проведена 20 лошадям с различными повреждениями сухожилия поверхностного и глубокого сгибателя пальца и повреждениями среднего межкостного мускула. Кроме этого, мезенхиальные стволовые клетки  были применены 5 собакам с повреждением крестовидных связок и артрозом коленного и локтевого суставов. Результаты подобного лечения в нашей клинике показывают, что более в 80 % лошадей и собак не только прекращают хромать, но и возвращаются на прежний уровень спортивной нагрузки. Насколько эта процедура полезна и успешна  показывает пример известной спортивной лошади –  Канцлер,  у которой в 2012 году было диагностировано  повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца 3 степени (т.е. 50 %  разрыва сухожилия). После применения стволовых клеток эта лошадь не только перестала хромать, но и заняла 2. место в  главном дерби  рысаков России 2013 года.

 

Что такое регенеративная медицина с применением столовых клеток при повреждении сухожилий ?

Регенеративные методы лечения – это новая, бурно развивающаяся область в ветеринарной медицине. Суть таких методов заключается в стимуляции восстановления поврежденных сухожилий  (или других ткани) с помощью клеток, взятых из организма лошади (аутологичных клеток). Аутологичные клетки не отторгаются организмом после введения, поскольку распознаются его защитными системами как собственные. Регенеративные методы лечения повреждения сухожилия предполагают использование, либо  применение стволовых клеток (выращенных из костного мозга и жировой ткани),  либо применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, или плазмы, богатой антагонистом рецептора интерлейкина 1.

На сегодняшний момент в мире больше всего применяются стволовые клетки при повреждении сухожилий лошади. Существуют мезенхимальные (стромальные), фетальные и эмбриональные стволовые клетки. Отличие между ними заключается в том, что эмбриональные и фетальные стволовые клетки значительно активнее мезенхимальных; они обладают более высокой способностью размножения, большим потенциалом дифференцировки, а получить их можно только на ранней стадии развития эмбриона или плода лошади. В настоящее время по способу получения выделяют две группы стволовых клеток: аллогенные стволовые клетки (полученные из донорского материала) и аутологичные (собственные) стволовые клетки. Для того чтобы минимизировать опасность иммунного ответа и реакции, в регенеративной медицине лошадей применяются прежде всего аутологичные (собственные) стволовые клетки. Основным источником мезенхимальных стволовых клеток (МСК) до недавнего времени считались костный мозг и периферическая кровь, но трудности, возникающие при проведении биопсии, вынудили исследователей искать новые возможности получения таких клеток. В настоящее время одним из основных источников клеточного материала, пригодного для удовлетворения потребностей регенеративной медицины, считаются мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани. Известно, что такой материал представляет собой малодифференцированные клетки с высокой пролиферативной активностью; эти клетки способны к самоподдержанию и дифференцировке в более чем один тип клеток, а также к миграции в места повреждения и регенерации тканей. Жировую ткань для выращивания стволовых клеток берут асептическим путем из области основания хвоста лошади, находящейся под седацией.

Пробирка с жировой тканью доставляется в лабораторию,  специализирующуюся на переработке и выращивании стволовых клеток из жировой ткани животных, как например Центр ветеринарной клеточной медицины в Москве.

zabor_zhirovoj_tkani

Выделение клеток в лаборатории проводят в ламинарном боксе, в стерильных условиях. Важным аспектом обеспечения биобезопасности клеточных продуктов является применение стандартизованных протоколов культивирования и использование расходных материалов, предназначенных именно для этого типа клеток и сертифицированных соответствующим образом. При выделении клеток из жировой ткани используют стандартный протокол: ткань помещают в пробирку, добавляют фосфатно-солевой буфер и центрифугируют. После отмывки жир взвешивают и добавляют раствор коллагеназы IA до конечной концентрации 0,075%, затем инкубируют на водяной бане при 37 °С, 30 минут, периодически встряхивая. После инактивации фермента средой, содержащей фетальную сыворотку, повторно центрифугируют, полученный осадок ресуспендируют и пропускают через клеточный фильтр. В аликвоте среды с клетками подсчитывают количество ядросодержащих клеток. Выращивание культуры клетокПлотность посадки составляет 3×105 ядросодержащих клеток на см2. Через 24 часа культуры отмывают от не прикрепившихся клеток фосфатным буфером и заменяют среду культивирования на свежую. Пассируют клетки в течение 7–10 дней при достижении 70–80%  конфлюэнтности, т.е. выращивают до 2 000 000 стволовых клеток в 1 мкл. При этом используются специальные дифференцировочные среды, которые позволяют индуцировать дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в трех «ортодоксальных» направлениях: остеогенном, хондрогенном и адипогенном. Одним из главных условий биобезопасности при культивировании клеток является обеспечение стерильности на всех этапах работы, предотвращение возможной контаминации вирусами, бактериями и микоплазмами. Цитогенетическое исследование клеток является одним из важнейших этапов контроля при ведении культур мезенхимальных стромальных клеток. Это позволяет определить генетическую стабильность клеточных линий и исключить клеточные культуры, несущие хромосомные перестройки, что обеспечивает большую безопасность при проведении клеточной терапии.Культура клеток под микроскопом После получения культур стволовых клеток и оценки их биобезопасности они могут быть разделены на терапевтические дозы и помещены на хранение в криобанк при температуре –196 °С.  В условиях глубокой заморозки клеточные продукты могут храниться неограниченно долгое время без потери своих свойств и жизнеспособности.

После выращивания культура стволовых клеток направляется из лаборатории в ветеринарную клинику, где асептическим путем под ультразвуковым контролем вводитсяточно в место повреждения сухожилия . Ведение под контролем УЗИСтволовые клетки, помимо стимуляции синтеза коллагена типа 1, выделяют трансформирующий фактор роста, подавляют активность Т-лимфоцитов и производство фактора некроза опухоли и интерферона, а также уменьшают апоптоз (запрограммированную гибель) теноцитов.  При использовании выращенных стволовых клеток число успешных излечений поврежденного сухожилия лошади вырастает до 90%, а количество повторных повреждений, наоборот, уменьшается на 18%, в то время как при стандартных медикаментозных методах лечения рецидив наблюдается в среднем в 56% случаев. Новые исследования показывают, что применение стволовых клеток не дает значительного сокращения времени репарации (регенерации), но сильно повышает прочность сухожилия, так как уменьшается формирование фиброзного шрама. Стволовые клетки желательно применять в первые 12 дней после повреждения. Наибольший эффект достигается при лечении повреждения поверхностного сгибателя пальца. Успех лечения хронических повреждений сухожилий с применением стволовых клеток достигается в 71% случаев.Спустя 3 месяца после введения