Первое применение в Российской Федерации прямой генотерапии у лошадей с повреждением сухожилий и связок

Уважаемые коллеги !

С радостью хотим Вам сообщить, что ветеринарная клиника КСК «Новый Век», под руководством профессора, доктора ветеринарных наук Ковач Миломира первый раз в Российской Федерации начала применять прямую генотерапию с фактором роста VEGF и FGF при повреждении сухожилий и связок у лошадей.
На шести лошадях было проведено первое не только в Российской Федерации, но и в Европе, успешное введение генотерапевтического препарата, содержащего последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) для восстановления тяжёлого повреждения поддерживающей связки и сухожилия поверхностного сгибателя пальца.
Гены с этим полезным фактором роста при лечении повреждений сухожилий у лошадей - VEGF и FGF был предоставлен нашей клинике, доктором Ярославом Литвином из Казанского государственного медицинского университета Росздрава.

Суть метода – генотерапии:

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств генетически изменяемого или модифицированного организма. Первая работа с применением генотерапии  в медицине людей была начата английским учёным Ф. Сенгером и У. Гилбертом, которые по этой причины получил Нобелевскую премию по 1980 г.

Как известно, в генах содержится информация - инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены.  По этой причини основные этапы решения генно-инженерной терапии следующие:

1.Получение изолированного гена.

Процесс синтеза генов при геноинжинерии в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей, т.е. гена ответственного за синтез желательного белка. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды).  Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс были удостоены Нобелевской премии (1988 г.).

2. Введение гена в вектор для переноса в организм

Чаще всего как вектор в генотерапии  используется аденовирусы или плазмиды.В нашем случаю мы использовали плазмиды. Плазмиды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также и эукариот. Для проведения восстановления поврежденной соединительной ткани сухожилия и связки была создана Казанским государственным медицинским университетом генетическая конструкция на основе плазмидной ДНК (названная pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2). В качестве основы для вектора был использован плазмид pBudCE 4.1 (Invitrogen), в который для одновременной экспрессии были клонированы видоспецифичные и кодон-оптимизированные гены лошадиVEGF-164 (сосудистого эндотелиального фактора роста 164) и FGF2 (основного фактора роста фибробластов) под контролем промоторов EF-1α и CMV соответственно. Создание генетической конструкции проводили стандартными генно инженерными методами ДНК-клонирования, с последующей наработкой и очисткой плазмидной ДНК в препаративном количестве и пригодной для инъекции в организм животного. Полученный стерильный препарат содержал ≥95% суперскрученной формы плазмидной ДНК, по данным анализа с помощью электрофореза в агарозном геле. Концентрация эндотоксина составила ≤0.03 EU/ug. Сухой препарат плазмидной ДНК в дозе 5 мг хранился при температуре -20ºС.

3. Перенос вектора с геном в поврежденный участок организма.

В нашем случае это введение в острое поврежденное сухожилие поверхностного сгибателя пальца и поддерживающей связки у лошади геннотерапевтического препарата в плазмиде, содержащего последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2).

Почему мы использовали гены белков фактора VEGF и FGF роста при повреждении сухожилия ?

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF; Vascular endothelial growth factor) — сигнальный белок, вырабатываемый клетками для стимулирования васкулогенеза и ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе), обеспечение коллатерального кровообращения. Белки VEGF служат частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям в ситуации, когда циркуляция крови недостаточна.
Факторы роста фибробластов (FGFs), относятся к семейству факторов роста, участвующих в ангиогенезе, заживлении ран и эмбриональном развитии (миогенное действие), а также в процессах пролиферации и дифференцировки широкого спектра клеток и тканей.

Как мы делали подготовку и введение генетического препарата:

Препарат в пробирке растворили в 5 мл стерильного физиологического раствора 0,9% NaCl до конечной концентрации 1 мг/мл. Растворенный препарат поставили на ночь при +4ºС в холодильник, периодически перемешивая покачиванием и переворачиванием. Перед самим введением в повреждённую ткань, растворенный препарат нагревали до температуры +37ºС. Набрали в шприц 3.5 мл раствора препарата от общего объема и под ультразвуковым контролем и при асептических условиях ввели в место повреждения сухожилия у лошадей. Набранный объем использовали для обкалывания самого места поврежденной и прилегающих здоровых тканей. Для лечения повреждения связки и сухожилия применяли только однократное введение препарата. После введения препарата на конечность поставили плотную повязку и предоставили лошадям строгий покой в течение 2-х дней, а потом назначили шаговую нагрузку в течение 3-х недель.

Эффект лечения оценивали в условиях ветеринарной клиники при помощи регулярного клинического наблюдения, физиологических тестов и ультразвуковой диагностики. Как результат в период от 2-3 месяцев наблюдается полное восстановление функциональной способности поврежденной связки и сухожилия после проведенного геннотерапевтического лечения у 5 лошадей (полный возврат на прежний уровень спортивной нагрузки). У одной лошади произошел рецидив заболевания.

ОБСУЖДЕНИЕ

Повреждение сухожилия сгибателя пальца, в том числе и поддерживающей связки, очень частая ортопедическая проблема спортивных лошадей, которая в значительном количестве случаев приводит не только к временной хромоте, но и к рецидивам заболевания с преждевременным окончанием спортивной карьеры таких лошадей.
В нашей клинике в период за 2016 год было применено у 6 лошадей с различным острым и высокой степени повреждения сухожилия поверхностного сгибателя пальца и поддерживающей связки (средний межкостной мышцы) плазмиды cкДНК геном с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактором роста фибробластов (FGF- 2).
После применения плазмиды cкДНК геном сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF) можно наблюдать «неожиданно» быструю полную регенерацию сухожилия в период с 2 месяцев по 5 лошадей (измеряя эхогенность  и площадь повреждения, процент параллельности коллагеновых волокон), по сравнению с медикаментозным и остальным регенеративным методами лечения (как пример стволовые клетки, плазма обогащена тромбоцитам).
Причина быстрого действия на заживление повреждённой связки и сухожилия лошади при помощи прямой генной терапии с VEGF и FGF2 ещё недостаточно известно. На основе некоторых исследования, факторы роста VEGF и FGF2 — представляют собой полипептиды, которые в месте повреждения выделяют, прежде всего, тромбоциты, фибробласты и эндотелиальные клетки.
Можно предположить и следующий механизм действия: сухожилия и связочная ткань имеют низкую степень кровоснабжения, процент обновления клеток и метаболизм снижены по сравнению с другими тканями при повреждении. По этой причине, применение  плазмидов  cкДНК геном сухожилий и связок через усиление кровоснабжения, и пролиферации фибробласта (тендобласта) приводит к явному быстрому заживлению поврежденного сухожилия.  Механизм их действия сложный и тесно связан с другими факторами воспаления и регенерации. Прежде всего, считается, что они через усиленный  ангиогенез (процесс образования новых кровеносных сосудов) стимулируют транспорт к месту повреждения тендобластов (фибробластов) и мезенхимных стволовых клеток, которые ответственны за продукцию коллагена и других составляющих частей внеклеточных компонентов сухожилий и связок – протеогликанов, гликозаминогликанов и гликопротеинов.
Генная терапия, как одна от самых передовых технологии в медицине, кроме лечения наследственных заболеваний, открывает постоянно новые возможности для клинического лечения многочисленных ортопедических заболеваний, в этом числе повреждения сухожилия и связки. Поэтому использование технологии рекомбинантной ДНК (прямой генной терапии) имеет большую перспективу при лечении ортопедических заболеваний не только лошадей, но и других видов животных и человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ветеринарной клинике КСК «Новый Век» был успешно протестирован геннотерапевтический препарат, содержащий последовательности генов сосудистого эндотелиального фактора роста 164 (VEGF-164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).Исследования были проведены на шести спортивных лошадях, имеющих различные степени повреждения сухожилий и третьего межкостного мускула . Это инновационный метод в ветеринарной практике лошадей, не только в России, а также и в Европе.

Постскриптум:

 Рис 1. Схема применения генотерапии при повреждении сухожилия

 Рис 2. Схема введения синтетического гена в плазмид

Рис 3. Плазмид с синтетическим геном.

Рис 4. Препарат плазмида с синтетическим геном

Рис 5. Приготовление препарата для введения в сухожилия

Рис 6. Введение препарата в поврежденное сухожилие

Рис 7. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца до введения преперата

Рис 8. Повреждение сухожилия поверхностного сгибателя пальца через два месяца после введения преперата